纳米孔靶向测序技术助力感染性疾病的临床 [复制链接]

临床探案

咳咳咳，慢阻肺急性发作的幕后黑手被抓到了

苏大爷20年来有慢性咳嗽咳痰，诊断为慢性阻塞性肺疾病，近日来咳嗽咳痰加重，伴有发热，最高体温为38℃，有心慌胸闷、喘气等症状。医院就诊，予以抗感染对症治疗后未见明显好转。今为求进一步诊治来我院。患者白细胞24.72X10^9个/L，PCT0.ng/mL，提示败血症，取患者肺泡灌洗液行呼吸道感染病原菌检测（纳米孔靶向测序），24小时后报告检出皮疽奴卡菌。奴卡菌感染的诊断主要依据病原学培养，由于其生长缓慢，初代分离常需培养1周，最快需要48小时才有肉眼可见的小菌落生长，而且在培养基中常被其它正常菌群覆盖或抑制，培养阳性率较低，容易造成误诊、漏诊，因此仅靠病原学培养结果容易延误病情。本案例，利用纳米孔测序技术检测原始样本中病原体16S核糖体RNA（16SrRNA）基因全长，成功检测出皮疽奴卡菌。奴卡菌治疗首选磺胺甲噁唑／甲氧苄啶（别名，复方新诺明）。这种药，一天仅需几块钱。在调整抗感染治疗方案后，苏大爷病情得到了好转。

“重症肺炎”的凶手，不止一个！

刘女士一周前劳累后受凉突发发热，最高39℃，伴头晕头痛，伴畏寒寒战，伴纳差、全身乏力、四肢肌肉酸痛，口干咽部不适，伴盗汗，略有喘息、呼吸困难。医院给与头孢抗感染、双氯酚酸钠、激素等对症支持治疗后效果不佳。今患者为求进一步诊治，遂来我院就诊。患者流感病*抗原快速检测显示甲型流感病*阳性（+）。予以抗病*[奥司他韦]治疗后患者仍有发热头痛等症状。为进一步查明原因，取患者痰液标本行呼吸道感染病原菌检测（纳米孔靶向测序），次日报告检出鹦鹉热衣原体加用莫西沙星抗菌治疗，几日后患者病情好转。鹦鹉热衣原体感染引起鹦鹉热肺炎，又称“鸟疫”，主要寄生在鸟类、家禽的组织、血、粪便甚至生活环境中。感染鹦鹉热衣原体后，可引起类似流感的全身症状，表现为头痛、肌肉酸痛、高热、呼吸困难等；重症者可累及全身多个器官，包括肺、肝、脾、肾脏及中枢神经系统，造成多器官功能衰竭而危及生命。治疗首选四环素类，包括多西环素、米诺环素，次选大环内酯类，氟喹诺酮类对鹦鹉热衣原体有效。鹦鹉热衣原体肺炎的确诊较为困难，也易漏诊或误诊，及时诊断和治疗干预，可以有效阻止重症化。

纳米孔测序原理

对基因测序本质上就是识别ATCG四种碱基，目前主流的检测方法包括将碱基转换为溶液PH值、光信号和电信号，通过检测放大后的信号来区分这四种不同碱基。Sanger测序Illumina、BGIseq、Pacbio等平台利用光信号，Iontorrent利用溶液PH值，而纳米孔测序利用电信号。

图1.ATCG四种碱基的化学结构

纳米孔测序是将人工合成的一种多聚合物的膜浸在离子溶液中，多聚合物膜上布满了经改造的穿膜孔的跨膜通道蛋白（纳米孔），由于纳米孔的直径非常细小，仅允许单链核酸通过，大量的纳米孔附着在一层生物膜表面，生物膜通有稳定的电流并实时监控，由于核酸中不同ATCG碱基的带电性质不一样，在穿过生物膜时，引起了相应的电流变化并被实时监控，通过电信号的差异就能检测出通过的碱基类别，从而实现测序。这种测序方式最大的优势就在于长读长测序和实时测序分析：

（1）长读长测序：纳米孔测序仪上嵌有纳米级生物孔道（Nanopore孔），每个纳米孔仅能容纳一条单分子核酸链通过，识别通过的碱基序列，可允许通过核酸链为全长，无需打断，无需拼接，实现长度长测序保证其物种鉴定准确性。

（2）实时检测：通过检测通过纳米孔的单分子核酸链产生的电信号→碱基识别→序列→快速生信分析平台→确定微生物种类，实现实时测序+边测序边分析，最快5min产出数据，24h正式报告。

图2.纳米孔测序纳米级生物孔道检测示意图

纳米孔靶向测序的优势

临床诊断感染性疾病的金标准是通过病原体培养，但这种方法的时间长、灵敏度较低，对于及时指导抗菌治疗而言太慢。PCR、LAMP检测等分析虽然能对感染性疾病的诊断提供比较准确依据，但是靶向单一，只能检测到一种或几种病原体。如今，纳米孔靶向测序（NanoporeTargetedSequencing，NTS）点亮了感染性疾病诊断之路。

本实验室创造性融合纳米孔测序仪和靶向测序技术，形成NTS检测方案，以16S和ITSrRNA为靶基因，鉴定临床样本中的细菌或真菌，取样-检测-报告整体时间可控制在24小时内。目前该测序技术现已成功应用到呼吸系统、神经系统、血液系统、泌尿系统、创口感染、胸腹腔感染等病原菌检测，并呈现出了常规检测手段以及普通测序仪所无法比拟的特异性、时效性。

表1.纳米孔靶向测序临床应用场景

样本类型

取样要求

创口病原菌感染

组织、脓液、玻璃体、房水、分泌物拭子

无菌容器

神经系统病原菌感染

脑脊液、脓液、组织

无菌容器

胸腹腔病原菌感染

胸腹水穿刺液、引流液、组织

无菌容器

呼吸道系统病原菌感染

肺泡灌洗液、吸痰、咳痰、肺组织

无菌痰杯

血液系统病原菌感染

外周血

紫头管（EDTA抗凝）

泌尿系统病原菌感染

清洁中段尿、穿刺尿

无菌尿杯

参考来源：

1.SIFIC感染官微